聽(tīng)老師將講HPLC的計算

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HPLC中涉及到計算的，主要是流動(dòng)相配制和含量計算。RP-HPLC一般用緩沖鹽配合甲醇乙腈作為流動(dòng)相，計算主要涉及到如何配制流動(dòng)相的問(wèn)題。同時(shí)還要考慮到流動(dòng)相配制的數量問(wèn)題。HPLC計算主要運用外標法。內標法在HPLC分析中，運用不多。所以略講。

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1、流動(dòng)相配制的計算

流動(dòng)相在HPLC中起到運輸樣品的作用。而流動(dòng)相準確地配制，在HPLC測試中有著(zhù)重要的作用。準確地配制流動(dòng)相能夠保證測試中保留時(shí)間的重復性。所以，配制起來(lái)不能掉以輕心。

對于流動(dòng)相配制，我把它概括為以下幾個(gè)字。

計算，稱(chēng)量，溶解，調節，<混合>，過(guò)濾，脫氣。為什么我把“混合"外加了個(gè)框呢？這就是涉及到你的設備是否是單元泵還是多元泵的問(wèn)題了。如果只有一臺單元泵，也無(wú)電磁閥切換功能的泵，需要混合這個(gè)步驟，而多元泵，或者低壓梯度切換的，可以不需要所謂的混合。各走各的。

打個(gè)比方說(shuō)，如果我的流動(dòng)相是：甲醇：純水=60：40（v/v），對于單元泵，那么只能甲醇和純水混合，作為流動(dòng)相，而多元泵或者多元梯度泵，則可以有兩路，A路放甲醇， B路放純水，A與B各比例控制為60%，和40%。

對于HPLC 配制流動(dòng)相，要保證流動(dòng)性配制準確，也要保證流動(dòng)相配制足量，不多不少，這樣保證在這批測試中，流動(dòng)相不至于不夠，也不致于太多而浪費，流動(dòng)相一般需要在2-3天內用完。那么首先確定流動(dòng)相要配制多少。舉一個(gè)例子。

例

要分析30個(gè)樣品，10個(gè)對照品，樣品和對照品都分析2次。一個(gè)試樣分析20分鐘，流速為1.2ml/min。那么我要配制多少ml的流動(dòng)相呢？通過(guò)計算來(lái)解決。（注：自動(dòng)進(jìn)樣，連夜分析，可以設置停止泵程序）

一般來(lái)說(shuō)，試樣設置20分鐘，還需要考慮進(jìn)樣的時(shí)間。假設進(jìn)樣時(shí)間為三分鐘，那么一個(gè)試樣所需要的時(shí)間為23分鐘。我們可以計算：

根據計算，需要配制2208ml流動(dòng)相。對于流動(dòng)相，我們不能配制得太摳，需要考慮到吸濾頭占的空間，那么我們再多配制個(gè)100-300ml，這取決于你的瓶底胖瘦。能夠保證不被吸空為宜。那么我們就配制2500ml吧。

對于流動(dòng)相如何配制，我們給一個(gè)實(shí)例

比如我要測試中藥一清膠囊，我們翻閱中國藥典，得以下信息。

一清顆粒是由黃連，大黃，黃芩（qin）組成。一般用于清熱瀉火解毒，化瘀涼血止血。用于火毒血熱所導致的身熱煩躁，目赤口瘡，咽喉牙齦腫痛，大便秘結，吐血，咯血咽喉炎，扁桃體炎，牙齦炎等上述癥候者。

其中黃芩主要成分黃芩苷用HPLC方法測試。先摘入如下：

色譜條件與系統適應性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇-0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液（pH=2.7）(42:58 v/v)為流動(dòng)相，檢測波長(cháng)為275nm。有效塔板數按黃芩苷峰計算不低于5000

我們看到，其流動(dòng)相是：甲醇-0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液（pH=2.7）(42:58 v/v)，那么也就是說(shuō)有水相識0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液，其pH=2.7（用磷酸調節），有機相是甲醇。

要注意，對于HPLC用的試劑，水，溶劑，都是需要好的。試劑一般在分析純以上。最好用優(yōu)級純，溶劑一般用HPLC級別。水用超純水。所有的溶劑，溶液，都需要用0.45微米（或更細）的微孔濾膜濾過(guò)。也要保證溶劑瓶清洗干凈。干燥。

流動(dòng)相脫氣是很重要的，現在一般的儀器都有在線(xiàn)脫氣。當然，在配制流動(dòng)相前脫氣，亦重要。一般脫氣又抽真空脫氣，超聲波脫氣，吹He脫氣，加熱回流脫氣等。常用的是前兩個(gè)脫氣方法。當然，抽真空脫氣效率比較高，但是要注意有機相是否在抽真空后比例改變的問(wèn)題。所以，對于混合兩相的流動(dòng)相，最好單獨濾過(guò)，再混合?；旌虾笠话銜?huì )產(chǎn)生氣體，用效率略低的超聲波脫氣即可。超聲波脫氣，只要看到無(wú)明顯氣泡即可使用。

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二．含量計算

對于HPLC，我們一般使用外標法計算。那么有同學(xué)問(wèn)，那么為什么內標法很少在HPLC上使用呢?

那么我們看下氣相色譜和HPLC不同的進(jìn)樣方式。GC手動(dòng)進(jìn)樣還是依靠進(jìn)樣針的定量進(jìn)樣，因為進(jìn)樣量很少，以微升計，所以，稍稍不留神，就有可能多進(jìn)或者少進(jìn)樣。而且，進(jìn)樣針上的刻度也很粗，所以，GC用手動(dòng)進(jìn)樣，使用外標法確實(shí)很考驗測試者的嫻熟技巧和過(guò)人的眼力。而內標法在GC進(jìn)樣測試中，由于內標物的調節作用，可以使得由于進(jìn)樣誤差降低到最小，其相關(guān)的文章，查閱qinqingcao在本論壇的文章。但是HPLC進(jìn)樣是六通閥進(jìn)樣，其有一根定量環(huán)，如果手動(dòng)進(jìn)樣能夠保證定量環(huán)是充滿(mǎn)樣品溶液的，那么進(jìn)樣誤差就幾乎不存在。況且內標法需要尋找合適的內標物質(zhì)，同時(shí)配制內標物，比較麻煩，所以在HPLC中很少聽(tīng)說(shuō)用內標法定量計算。更多的，是使用外標法計算。

所以，HPLC手動(dòng)進(jìn)樣一般使用3倍量的定量環(huán)進(jìn)樣。也就是說(shuō)，20微升的定量環(huán)，我要注入60微升以上的樣品溶液。保證定量環(huán)中充滿(mǎn)著(zhù)樣品溶液。而多余的樣品溶液會(huì )被排除。這樣保證每次進(jìn)樣都是定量環(huán)中的那些量。對于定量環(huán)，這個(gè)體積一般也不是正好是20.00微升，但是我們保證進(jìn)樣過(guò)量（多余的溶液會(huì )被排出），則能夠保證進(jìn)樣都是按照定量環(huán)中的體積進(jìn)入色譜系統，這樣消除進(jìn)樣的誤差。對于定量環(huán)，在做完樣品后需要用無(wú)溶質(zhì)的流動(dòng)相清洗數遍。如果定量環(huán)真的很臟，無(wú)法清洗了，那么可以裁剪一段管徑和定量環(huán)相同的干凈的不銹鋼管，裁剪長(cháng)度和定量管相同，安裝上去。當然資金充裕的話(huà)，也可以購買(mǎi)廠(chǎng)家的定量環(huán)。

當然現在自動(dòng)進(jìn)樣器很普及，那么使用自動(dòng)進(jìn)樣器就更加方便了。

對于外標法，實(shí)際上也就是用已知濃度的對照品（標準品）來(lái)對樣品中的該物質(zhì)。這實(shí)際上很象砝碼和天平。標準品就如同砝碼，在同樣的色譜條件下，標準品的峰面積和濃度已知，而樣品中的峰面積可以測試出來(lái)，這樣通過(guò)比例式子比較出樣品中該物質(zhì)的濃度了。

在這里，我想和大家說(shuō)明的是，一般是通過(guò)保留時(shí)間做定性的。比方說(shuō)，我測試維生素C，維生素C標準品在一定的色譜條件下，其保留時(shí)間為2.4分鐘；樣品在同樣的色譜條件下，2.4分鐘有峰，一般認為是樣品中也許有維生素C。當然，保留時(shí)間定性確實(shí)有其局限，但是沒(méi)有其他手段，那么保留時(shí)間還是能夠發(fā)揮定性的作用。

對于定量，外標法定量，如果做的準確的話(huà)，需要用多點(diǎn)（濃度）定量。然而在企業(yè)用單點(diǎn)法定量還是很多的。對于做線(xiàn)性，精密度，回收率，這些內容我們在方法學(xué)驗證中講授，這里我還是著(zhù)重講解單點(diǎn)法校正。

在講單點(diǎn)法校正，我先問(wèn)同學(xué)們一個(gè)問(wèn)題，如何用簡(jiǎn)單的方法來(lái)測試校園中的樹(shù)高度？

通過(guò)一根已知高度的biao桿，在太陽(yáng)下投射在地面的陰影的長(cháng)度，計算出樹(shù)的高度。同樣道理，我們也是用已知的標準品的濃度和峰面積，用樣品中同一物質(zhì)的面積，計算出樣品中的那個(gè)物質(zhì)的濃度。根據稀釋倍數計算出樣品中，該物質(zhì)的含量。

如果與標準曲線(xiàn)聯(lián)系起來(lái)，這個(gè)就是單點(diǎn)法。也就是說(shuō)，以0為圓心，標準品濃度和面積在二元坐標的一點(diǎn)的連線(xiàn)作為校準曲線(xiàn)。得y=ax 其中的a就是斜率，也就是面積隨著(zhù)濃度的變化而變化，其變化率為a。

那么樣品濃度的計算，就是按照其峰面積在坐標上的點(diǎn)，對應的濃度。用以下公式計算。

單點(diǎn)法：

我們給出一個(gè)例題。

例

測試果汁中維生素C含量。配制20mg/100ml的維生素C作為標準品。稱(chēng)取20.005g果汁到50ml容量瓶中，加入流動(dòng)相溶解定容搖勻。濾紙過(guò)濾。吸取濾液10ml到50ml容量瓶中。流動(dòng)相定容搖勻。標準品和樣品均吸取20μl進(jìn)色譜，分別得到峰面積24336（標準品），20129（樣品）。計算果汁中維生素C含量（mg/100g）

                                                                                                                                       本篇轉載至液相色譜之家